Роль местного иммунитета в механизме развития различных вариантов преждевременных родов

Цель исследования: изучение особенностей акушерско-гинекологического анамнеза  в основной группе пациенток с преждевременными родами в анамнезе.

Материалы и методы. Обследованы 52 пациентки в возрасте от 19 до 41 года с диагнозом преждевременные роды. Из них 28 беременных с преждевременным излитием околоплодных вод при отсутствии регулярной родовой деятельности (1А подгруппа) и 24 роженицы с истинными преждевременными родами. Группу контроля составили 25 женщин со своевременными родами. У всех пациенток определен уровень экспрессии м-РНК генов врожденного иммунитета (IL1B, IL10, IL18, TNFa, TLR4, GATA3, CD68, B2M) в цервикальном канале с помощью тест-системы ИммуноКвантэкс. Полученные результаты проанализированы стандартными статистическими методами.

Результаты. Выявлено достоверное снижение экспрессии генов TLR4 и GATA3 (p˂0,05), а также более высокий индекс воспаления (Me=99,5%, p˂0,01) у женщин с ПРПО при недоношенной беременности. Достоверных различий между группами истинных преждевременных и своевременных родов не обнаружено.

Выводы. Выявленные нами отличия в состоянии локального иммунного статуса при различных вариантах преждевременных родов свидетельствуют о разных механизмах инициации преждевременных родов.

Ключевые слова: врожденный иммунитет, ИммуноКвантэкс, локальный иммунный статус, преждевременные роды, синдром системного воспалительного ответа

Каткова Н.Ю.,  Бодрикова О.И.,  Безрукова И.М.,  ПокусаеваК.Б. Роль местного иммунитета в механизме развития различных вариантов преждевременных родов // Женское здоровье. 2018. № 3 (22).

На протяжении длительного времени проблема преждевременных родов (ПР) занимает одно из ведущих мест в современном акушерстве, а ее медицинская и социально-экономическая значимость неоспоримы [1]. ПР являются ведущей причиной неонатальной заболеваемости и смертности новорожденных. Так, на долю недоношенных детей приходится 60–70 % ранней неонатальной и 65–75 % детской смертности. Кроме того, не стоит забывать и о высокой стоимости выхаживания недоношенных детей, высокой частоте детской инвалидности, а также о возможности развития отдаленных неблагоприятных последствий недошенности [2, 3].

Несмотря на прогресс в оказании медицинской помощи, частота преждевременных родов за последние годы не имеет тенденции к снижению, а в некоторых странах даже отмечается рост этого показателя. По данным ВОЗ, 15 миллионов детей ежегодно рождаются преждевременно (до полных 37 недель беременности). Показатели преждевременных родов варьируют от 5 до 18 % в разных странах мира, в РФ этот показатель составляет 6 – 15 % в различных регионах [4].

Согласно классификации преждевременные роды подразделяются на спонтанные (70 – 80 % всех преждевременных родов) и индуцированные (20 – 30 %), которые связаны с состоянием здоровья беременной и/или плода

[5, 6]. Самопроизвольные роды могут начинаться как с развития регулярной родовой деятельности при целом плодном пузыре (истинные преждевременные роды, на их долю приходится около 40 – 50 % случаев), так и с преждевременного разрыва плодных оболочек при отсутствии регулярной родовой деятельности (около 50 %) [7, 8].

Большинство исследователей в вопросах патогенеза преждевременных родов склоняются к тому, что в механизме их развития реализуются непосредственно две основные тенденции: преобладание невоспалительных и инфекционных причин. По данным литературы около 40 % преждевременных родов обусловлены инфекционными факторами [6, 7, 9]. К ведущему патогенетическому механизму в реализации преждевременных родов инфекционного генеза относят развитие неспецифического системного воспалительного ответа организма на инфекционные агенты. При синдроме системного воспалительного ответа (ССВО) локальное повреждение тканей в зоне инокуляции инфекционных патогенных агентов вызывает совокупность системных реакций. Это ассоциировано с дисфункцией врожденного и приобретенного иммунитета и проявляется нарушением соотношения про и противовоспалительных цитокинов.  В настоящее время активно изучается роль цитокинов в реализации преждевременных родов [10]. Так, имеются сведения о том, что повышение уровня провоспалительных цитокинов в содержимом цервикального канала свидетельствует о возможном риске ПР [11].  Получение данных о состоянии локального иммунного статуса позволяет уточнить молекулярно-биологические аспекты развития различных вариантов ПР.

Целью настоящего исследования явилось изучение особенностей локального иммунного статуса при различных вариантах преждевременных родов.

Пациенты и методы

Для выполнения поставленной цели нами было обследовано 77 рожениц, разделенных на две группы. Первую (основную) группу составили 52 пациентки с диагнозом спонтанные преждевременные роды на сроке 22 – 36 недель беременности. В соответствии с вариантами развития преждевременных родов основная группа была разделена на 2 подгруппы. В первую подгруппу (1А) вошли 28 беременных с преждевременным разрывом плодных оболочек (ПРПО) при отсутствии регулярной родовой деятельности. Вторая подгруппа (1В) была представлена 24 роженицами с развитием регулярной родовой деятельности при целом плодном пузыре. Вторую группу (контрольную) составили 25 женщин со своевременными родами.

Едиными критериями включения во все группы были одноплодная беременность и информированное добровольное согласие на участие в исследовании. Критерии исключения: многоплодная беременность, тяжелые врожденные пороки развития плода.

Исследование проводилось на базе государственного бюджетного учреждения здравоохранения Нижегородской области (ГБУЗ НО) «Дзержинский перинатальный центр» в период с 2016 по 2017 год.

Для оценки локального иммунного статуса рожениц с началом родов мы забирали соскоб из цервикального канала стерильным одноразовым зондом. Биоматериал помещался в пластиковые пробирки объемом 1,5 мл, которые содержали 500 мкл среды для стабилизации РНК. Для выделения нуклеиновых кислот использовали наборы «Проба НК» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Далее осуществлялась постановка теста «ИммуноКвантэкс» (ООО «НПО ДНК-Технология»).  В данной тест-системе после выделения суммарного пула ДНК и РНК проводилась реакция обратной транскрипции для получения с матрицы м-РНК комплементарной ДНК, которая в дальнейшем амплифицировалась методом ПЦР.  После этапа амплификации по показателю индикаторного цикла программно рассчитывался уровень экспрессии мРНК генов врожденного иммунитета (IL1B, IL10, IL18, TNFa, TLR4, GATA3, CD68, B2M). На основе интегральной оценки полученных уровней экспрессии генов делалось заключение о наличии или отсутствии локальной воспалительной реакции по величине индекса воспаления (ИВ).  Значение ИВ больше 60 % оценивали как воспаление, при ИВ менее 50 % – отсутствие воспалительной реакции, диапазон 50 – 60 % – «нельзя исключить» (серая зона).

Анализ полученных данных проводился при помощи программ Microsoft Excel 2010 (надстройка AtteStat), STATISTICA ver.10.(StatSoft Russia). Количественные данные (уровни экспрессии генов) представлялись в виде медианы (Ме) и межквартального интервала (нижний (0,25) –  верхний (0,75) квартили). Для определения достоверности различий между исследуемыми группами рассчитывался критерий Манна-Уитни. Для оценки качественных признаков применялся хи-квадрат Пирсона с поправкой Йейтса, при частотах меньше 5 – двусторонний точный критерий Фишера (p). Для оценки связи факторов с развитием преждевременных родов рассчитывалась величина отношения шансов (ОШ) с доверительным интервалом 95 %. Для всех видов анализа статистически достоверными считались значения p ˂ 0,05.

Результаты исследования

Возраст исследуемых женщин варьировал от 19 до 41 года и составил в среднем 29,8 ± 5,0 лет. Нами не было выявлено достоверных различий в группах по этому показателю (p  > 0,05).

При оценке массо-ростовых показателей обнаружено, что более высоким значением индекса массы тела (ИМТ) обладали пациентки основной группы (с ПР), где среднее значение данного показателя равнялось 25,4 ± 5,2 кг/м², в то время как в контрольной группе он имел значение 22,5 ± 2,3 кг/м²(p = 0,009).  Принципиальных отличий в росте беременных не отмечалось (p > 0,05).

При анализе социально-экономического положения пациенток выяснилось, что в группе с преждевременными родами достоверно больше пациенток со средним образованием – 65,4 % (χ² = 6,3; p = 0,012) и одиноких женщин – 17,3 % (p = 0,02).

Изучение особенностей акушерско-гинекологического анамнеза показало, что только в основной группе встречались пациентки с преждевременными родами в анамнезе (15,4 %, p = 0,048; ОШ = 9,7 [0,5 -175,9]). Также в данной группе достоверно чаще присутствовали женщины с двумя и более лечебно-диагностическими выскабливаниями полости матки в анамнезе (34,6 %, p = 0,013; ОШ = 6,1[1,3 – 28,8]).

Нами были выявлены отличительные особенности акушерско-гинекологического анамнеза среди беременных с различными вариантами преждевременных родов. Так, в подгруппе с истинными преждевременными родами (1В подгруппа) статистически чаще встречались первобеременные женщины – 45,8 % (p = 0,038). Пациентки данной подгруппы достоверно раньше начинали жить половой жизнью, при этом средний возраст начала половой жизни 15,6 ± 1,3 года (p = 0,009). Кроме того, в 1В подгруппе 37,5% женщин отмечали наличие воспалительных заболеваний органов малого таза до беременности. Это достоверно больше, чем в 1А подгруппе (p = 0,045).

Анализ экстрагенитальной патологии исследуемых пациенток показал, что в основной группе (с ПР) было больше беременных с хронической никотиновой зависимостью (34,6 %, p = 0,013; ОШ = 6,0[1,29 – 28,8]) и хроническими специфическими инфекциями (хронический гепатит С, хронический гепатит В, ВИЧ-инфекция) – 13,5 %, p = 0,047; ОШ = 8,4 [0,5 – 153,3].

Наиболее частым осложнением беременности в основной группе в нашем исследовании оказалась угроза прерывания беременности, которая отмечалась у 44,2 % пациенток. В то же время эта патология в контрольной группе составила 12%, что достоверно меньше, чем в основной группе (p = 0,017; ОШ = 4,9[1,3 – 18,7]).  Формирование истмико-цервикальной недостаточности во втором триместре у пациенток с ПР выявлено в 19,2 % случаев, в контрольной группе беременных с ИЦН отмечено не было (p = 0,025; ОШ = 12,6[0,7-224,3]).

Пациентки основной группы достоверно чаще болели острыми инфекционными заболеваниями во время беременности (ОРВИ, инфекция мочеполовых путей, обострение пиелонефрита) – 36,5 %, p = 0,032; ОШ = 4,2[1,1 – 16,0]. Обращает на себя внимание тот факт, что у беременных с ПРПО (1А подгруппа) чаще диагностировалась острая инфекция по сравнению с группой истинных преждевременных родов (46,4 %, p = 0,044). Только в группе с преждевременными родами были зарегистрированы признаки хронической фетоплацентарной недостаточности, включая СЗРП – 13,5 % случаев, ОШ 8,4[0,5 – 153,3].  При этом следует отметить, что статистически чаще данное осложнение беременности встречалось в подгруппе с истинными преждевременными родами (25 %, p = 0,04).

Наиболее интересные данные нами были получены при изучении профиля экспрессии генов IL1B, IL10, IL18, TNFa, TLR4, GATA3, CD68, B2M в клетках соскобов из цервикального канала. При использовании тест-системы «ИммуноКвантэкс» мы обнаружили, что определение отдельных показателей локального иммунного ответа не имеет прогностической ценности в плане развития ПР. Так, в нашем исследовании оказалось, что не было достоверных различий по уровням экспрессии генов IL1B, TNFa, CD68, B2M ни по группам исследуемых, ну внутри основных подгрупп (p>0,05). В то же время у пациенток с ПРПО без развития регулярной родовой деятельности (1А подгруппа) значение экспрессии TLR4 было достоверно ниже, чем в 1В подгруппе c истинными преждевременными родами (p = 0,037). В контрольной группе уровень экспрессии TLR4 оказался самим высоким из исследуемых групп и отличался от показателей 1А подгруппы (p = 0,021), но не имел принципиальной разницы с данными 1В подгруппы (p = 0,408).

Достоверная разница была выявлена нами по уровню экспрессии транскрипционного фактора GATA3.  Установлено, что минимальное его значение отмечалось в подгруппе 1А (с ПРПО), а максимальный уровень зафиксирован в подгруппе 1В (p = 0,012), причем достоверной разницы между истинными преждевременными родами (1В подгруппа) и своевременными родами (контрольная группа) по этому показателю не было (p>0,05).

Нами также получены статистические отличия в экспрессиях генов IL10 и IL18 внутри основной группы. Так, в подгруппе с ПРПО (1А) значения данных показателей достоверно ниже по сравнению с 1В подгруппой истинных ПР (p = 0,021 и p = 0,025 соответственно).

Таким образом, увеличение или уменьшение экспрессии отдельных генов, обладающих про- и противовоспалительным действием, не дают полного представления об изменениях в состоянии мукозального иммунитета. В то же время интегральная оценка соотношений уровней исследуемых генов и рассчитанный на этой основе индекс воспаления (ИВ) позволяет сделать заключение о наличии или отсутствии воспалительной реакции. Полученные нами значения ИВ имели принципиальные различия как между основной (группа ПР) и контрольной группами, так и внутри основной группы. Самым высоким ИВ обладали пациентки подгруппы 1А (с ПРПО) – 99,5 %, в то время как в 1В подгруппе данный показатель составил 27,2 % (p <0,01), а в группе контроля – 13,1 % (p <0,01). Значения ИВ в подгруппе с истинными ПР (1В) и группе контроля оказались сопоставимы (p> 0,05).

Данные по уровням экспрессии исследованных генов и индексу воспаления представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Уровни экспрессии исследованных генов в подгруппах с преждевременными родами и группой контроля (медиана и межквартильный интервал)

 Примечание: p¹ –  значение между подгруппой с ПРПО (1А) и подгруппой с истинными ПР (1В); p² – значение между подгруппой 1А и контрольной группой; p³ – значение между подгруппой 1В и контрольной группой.

Обсуждение результатов

В настоящее время поиску причин и возможности прогнозирования ПР посвящено достаточно большое количество работ [1, 6, 10, 17]. Однако, несмотря на очевидный прогресс в познании причин и методах профилактики ПР, многие вопросы остаются до конца не выясненными. Так, к факторам риска по развитию ПР большинство исследователей относят: преждевременные роды, поздние выкидыши, медицинские аборты в анамнезе, никотиновую зависимость, низкий социально-экономический уровень жизни, стрессовую ситуацию, конизацию шейки матки, индуцированную беременность, цервико-вагинальную инфекцию, инфекцию мочевыделительной системы, тяжелую экстрагенитальную патологию [19].

Наши исследования подтвердили данные мировой литературы. Следует отметить, что кроме общеизвестных факторов мы отметили большой процент высокого ИМТ у женщин с ПР по сравнению с контрольной группой (p= 0,009). Таким образом, факторами риска ПР в данном исследовании явились: указания на преждевременные роды в анамнезе, два и более внутриматочных вмешательства, курение, нарушение жирового обмена, острые и хронические инфекции.

В последние годы развитие механизма ПР связывают с нарушением баланса про- и противовоспалительных субстанций. Тем не менее, единого взгляда на этот процесс нет. Так, при варианте ПР, начавшихся с ПРПО, с большей вероятностью (p <0,01) характерен высокий индекс воспаления. По данным отечественных и зарубежных авторов наиболее распространенным патогенетическим механизмом развития ПРПО является инфицирование нижнего полюса плодного пузыря [8, 12]. При попадании патогенных агентов в организм в работу вступает первая линия иммунологической защиты, представленная элементами врожденного иммунитета. Первичный воспалительный ответ на патогены опосредован специфическими Toll – подобными рецепторами (TLRs), активация которых происходит при взаимодействии с клеточной стенкой микроорганизмов. Результатом этого взаимодействия является увеличение синтеза провоспалительных цитокинов, хемокинов и простогландинов. Известно, что увеличение синтеза цитокинов в шейке матки является причиной лейкоцитарной инфильтрации и открытия шейки матки. Увеливающаяся при этом активность протеаз может приводить к дестабилизации плодных оболочек и их преждевременному разрыву [16]. Участие TLRs в развитии преждевременных родов подтверждено многими исследованиями [14].   Так, Тютюнник В.Л. и соавт. [17] в своем исследовании показали достоверное снижение экспрессии гена TLR-4 в группе женщин с преждевременными родами, однако эта закономерность выявлена при наличии дисбиотических нарушений микрофлоры влагалища у данных пациенток.

По данным других авторов [13, 15] при преждевременных родах наблюдается увеличение экспрессии гена TLR-4 и TLR-2 непосредственно перед родами как в слизистой оболочке цервикального канала, так и в плацентарной ткани. Повышенная экспрессия TLRs приводит к выбросу провоспалительных цитокинов, которые попадают в кровоток, в том числе и кровоток плода, и способствуют преждевременной активации кортикотропин-рилизинг гормона и плацентарно-надпочечникового эндокринного каскада. Результатом чего является повышение тонуса матки и возможность развития преждевременных родов.

В нашем исследовании мы не получили достоверных различий между группами преждевременных родов и своевременных родов по величине экспрессии большинства генов врожденного иммунитета (p>0,05). Как известно в норме при развитии физиологической беременности цитокины регулируют наступление родовой деятельности. Началу родов предшествует инфильтрация плаценты и окружающих материнских тканей различными цитокинами даже при отсутствии   инфекции. Результатом этой активации является синтез провоспалительных цитокинов IL-1, IL-6, IL-8, TNF и простагландинов, стимулирующих сокращение матки [17].

В нашей работе оказалось, что достоверной разницы между основной и контрольной группами по экспрессии гена TLR4 выявлено не было (p>0,05), что связано, по-видимому, с большой разнородностью синдрома ПР.

Изучение экспрессии генов TLR4 и GATA3 по подгруппам выявило принципиальные различия в их содержании при разных вариантах развития ПР. Так, у пациенток 1А подгруппы экспрессия TLR4 была достоверно снижена (p=0,037) по сравнению с подгруппой 1В (истинные ПР). Кроме того, имелись существенные однонаправленные отличия по этому показателю с контрольной группой (p=0,021). В то же время не было выявлено принципиальных изменений в концентрации TLR4 между 1В подгруппой (истинные ПР) и группой контроля (p>0,05). Похожая тенденция наблюдалась в отношении экспрессии гена GATA3, где минимальные значения наблюдались у пациенток 1А подгруппы (p <0,05).  Между показателями GATA3 в 1 в подгруппе и группе контроля различий не отмечено (p>0,05).

В доступной нам литературе нет упоминаний о значимости индекса воспаления (ИВ) в развитии ПР. В нашем исследовании ИВ составил 99,5 % у женщин с ПРПО (подгруппа 1А), что достоверно выше (p <0,01) в сравнении с 1В подгруппой – 27,2%. Одновременно с этим 1В подгруппа и группа контроля не отличались друг от друга (p>0,05).

Таким образом, оказывается, что соотношение TLR4/GATA3 и ИВ определяют начало ПР. Если процесс воспаления преобладает над противовоспалительными субстанциями, развивается каскад реакций, приводящий с ССВО и, как следствие, к ПРПО.

В случае истинных ПР, по-видимому, задействуются другие механизмы активации системы «мать-плацента-плод». Изучение их продолжается.

Выводы

1. Факторами риска развития преждевременных родов являются: преждевременные роды, поздние выкидыши и медицинские аборты в анамнезе; низкий социально-экономический уровень жизни; никотиновая зависимость; стрессовые ситуации; конизация шейки матки; индуцированная беременность; цервико-вагинальная инфекция; инфекция мочевыделительной системы; тяжелая экстрагенитальная патология.
2. Исследование «ИммуноКвантэкс» у пациенток с ПР позволяет определить состояние локального иммунного статуса и вариант развития ПР.
3. У рожениц с ПР и ПРПО в иммунном ответе преобладает реакция воспаления со снижением уровня экспрессии TLR4 и синхронного снижения GATA
4. Не выявлено достоверных различий в состоянии локального иммунного статуса при истинных преждевременных и своевременных родах.

1. Савельева Г.М., Шалина Р.И., Курцер М.А., Клименко П.А., Сичинава Л.Г., Панина О.Б. и др. Преждевременные роды как важнейшая проблема современного акушерства. Акушерство и гинекология. 2012; 8(2):4-10.
2. Серов В.Н., Сухорукова О.И. Профилактика преждевременных родов. Акушерство и гинекология .2014; (1):3-10.
3. Mattison D., Damus K., Fiore E., Petrini J., Alter C. Preterm delivery: a public health perspective. Paediatr Perinatal Epidemiol.2001; 15(2):7–16.
4. Сухих Г.Т., редактор. Кокрановское руководство: Беременность и роды. М: Логосфера 2010; 440с.
5. Радзинский В.Е. Акушерская агрессия. М.: Изд-во журнала StatusPraesens, 2012. 672с.
6. Romero R., et al. Mechanisms of Preterm Labor and Preterm Premature Rupture of the Membranes. Texbook of Perinatal Medicine, 2^nd Eds. A.Kurjak, F.Chervenak. 2012, 1769с.
7. Кан Н.Е., Санникова М.В., Амирасланов Э.Ю., Тютюнник В.Л. Клинические предикторы прогнозирования преждевременного разрыва плодных оболочек. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2013; 12(3): 12-18.
8. ACOG Practice Bulletin No. 160: premature rupture of membranes. Obstet. Gynecol. 2016; 127.
9. Власова Т.А., Вальдман С.Ф., Иванова Н.В. и др. Факторы риска и особенности ведения преждевременных родов. Репродуктивное здоровье женщины. 2000; 2:153–160.
10. Меджидова М.К., Тютюнников В.Л., Кан Н.Е., Курчакова Т.А., Кокоева Д.Н. Роль синдрома системного воспалительного ответа в развитии преждевременных родов. Проблемы репродукции. 2016.(2): 116-120.
11. Сидельникова В.М., Сухих Г.Т. Невынашивание беременности. М.: МИА. 2010; 536.
12. Петров С.Н. Проблема преждевременного разрыва плодных оболочек и тактика ведения преждевременных родов. Акушерство, гинекология и репродукция. 2012.6(1):50-52.
13. Adams Waldorf KM, Persing D, Novy MJ, Sadowsky DW, Gravett MG. Pretreatment with toll-like receptor 4 antagonist inhibits lipopolysaccharide-induced preterm uterine contractility, cytokines, and prostaglandins in rhesus monkeys. Reprod Sci. 2008;15(2):121-127.
14. Jones NM, Holzman C, Friderici KH, Jernigan K, Chung H, Wirth J, Fisher R. Interplay of cytokine polymorphisms and bacterial vaginosis in the etiology of preterm delivery. J Reprod Immunol. 2010; 87(1-2):82-89.
15. Макаров О.В., Бахарева И.А., Ганковская Л.В., Романовская В.В. Молекулярные механизмы инфекционного невынашивания беременности. Российский медицинский журнал. 2009;(2):24-28.
16. Макаров О.В., Романовская В.В., Кузнецов П.А., Магомедова А.М. Иммунологические аспекты преждевременных родов инфекционного генеза. Вестник РУДН, сер Медицина. Акушерство и гинекология, 2011. (6):373-379.
17. Тютюнник В.Л., Курчакова Т.А.,Кан Н.Е., Непша О.С., Донников А.Е., Меджидова М.К.и др.Локальные факторы врожденного иммунитета в прогнозировании преждевременных родов. Акушерство и гинекология. 2016;(10):59-63.
18. Osman I.,Young A., Ledingham M. et al Leukocyte density andproinflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. Mol. Hum. Reprod. 2003 (9). 41-45.
19. Saito S. Cytokine network at thefeto-maternal interface. J. Reprod. Immunol. 2000. (45):491-503.