Оценка миграции в эндометрий внутривенно введенных аутологичных мезенхимальных стволовых клеток с помощью определения экспрессии CD90+ у пациенток с синдромом Ашермана

Цель исследования: оценить способность внутривенно введенных аутологичных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) к миграции в эндометрий у пациенток, получающих МСК для лечения рефрактерного к заместительной гормональной терапии (ЗГТ) синдрома Ашермана.

Дизайн: проспективное рандомизированное исследование.

Материалы и методы. В исследовании участвовала 21 женщина с рефрактерным к ЗГТ синдромом Ашермана. У пациенток группы МСК (n = 11) проведено гистероскопическое разделение внутриматочных синехий, после чего выполнена трепан-биопсия костного мозга, из которого были выделены аутологичные МСК. Внутривенное введение МСК осуществлялось на 7–9-й день менструального цикла. У пациенток группы контроля (n = 10) выполнялось гистероскопическое разделение внутриматочных синехий с последующей циклической терапией эстрогенами-гестагенами. Биопсия эндометрия производилась дважды на 19–21-й день менструального цикла — до и через 3 месяца после лечения эстрогенами-гестагенами или МСК. В биоптатах оценивалась экспрессия CD90+.

Результаты. До проведения лечения экспрессия CD90+ в обеих группах обнаружена в строме у 40% пациенток. После терапии МСК экспрессия CD90+ обнаруживалась и в строме, и в железах у 91% пациенток.

Заключение. Полученные данные свидетельствуют о способности внутривенно введенных аутологичных МСК мигрировать в поврежденный эндометрий пациенток с рефрактерным к ЗГТ синдромом Ашермана и сохраняться в тканях эндометрия на протяжении 3 месяцев.

Ключевые слова: мезенхимальные стволовые клетки, регенеративная медицина, синдром Ашермана, эндометрий

Рыжов Ю.Р., Тапильская Н.И., Коган И.Ю., Толибова Г.Х., Гзгзян А.М. Оценка миграции в эндометрий внутривенно введенных аутологичных мезенхимальных стволовых клеток с помощью определения экспрессии CD90+ у пациенток с синдромом Ашермана // Женское здоровье и репродукция: сетевое издание. 2021. № 4 (51). URL: http://whfordoctors.su/statyi/ocenka-migracii-v-jendometrij-vnutrivenno-vvedennyh-autologichnyh-mezenhimalnyh-stvolovyh-kletok-s-pomoshhju-opredelenija-jekspressii-cd90-u-pacientok-s-sindromom-ashermana/ (дата обращения: дд.мм.гггг)

Intravenously administered autologous mesenchymal stem cells migration to endometrium assessment using CD90+ expression in patients with Asherman’s syndrome
J.R. Ryzhov¹, N.I. Tapilskaya^{1, 2}, I.Yu. Kogan¹, G.Kh. Tolibova¹, A.M. Gzgzyan^{1, 3
1} D.O. Ott Research Institute of Obstetrics, Gynecology, and Reproductology; Russia, St. Petersburg
² St. Petersburg State Pediatric Medical University; Russia, St. Petersburg
³ St. Petersburg State University; Russia, St. Petersburg

Study Objective: To assess the capability of intravenous administered mesenchymal stem cells (MSC) to endometrium migration in patients with refractory to hormone replacement therapy (HRT) Asherman’s syndrome.

Study Design: prospective randomized study.

Materials and Methods. Twenty-one women with refractory to HRT Asherman’s syndrome participated in the study. Women in MSC treatment group (n = 11) were submitted to intrauterine adhesions dissection and then to intravenous administration of bone marrow-derived MSC on the day 7–9 of menstrual cycle. Women in control group (n = 10) were treated with intrauterine adhesions dissection and hormone replacement therapy in cycle regimen for 3 months. Endometrial biopsy was performed on the day 19–21 of menstrual cycle in both groups twice: before treatment and 3 months after treatment. Expression of CD90+ was studied.

Study Results. Both in control group and in MSC treatment group CD90+ expression was observed in endometrial stroma in 40% patients. 3 months after MSC administration CD90+ expression was observed in endometrial stroma and glands in 91% patients.

Conclusion. Obtained data showed that intravenous administered MSC are capable to migrate to endometrium of patients with refractory to HRT Asherman’s syndrome and survive in endometrial tissue for 3 months.

Keywords: mesenchymal stem cells, Asherman’s syndrome, regenerative medicine, endometrium.

Ю.Р. Рыжов¹, Н.И. Тапильская^{1, 2}, И.Ю. Коган¹, Г.Х. Толибова¹, А.М. Гзгзян^{1, 3
1} ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта»; Россия, г. Санкт-Петербург
² ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; Россия, г. Санкт-Петербург
³ ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет»; Россия, г. Санкт-Петербург

Введение

Распространенность бесплодия в некоторых регионах может достигать 30% [1]. Одним из основных способов преодоления бесплодия является технология ЭКО. Однако само по себе ЭКО сравнительно эффективно лишь у тех пар, у которых бесплодие обусловлено ановуляцией, трубно-перитонеальным, шеечным или мужским фактором. В то же время у значительного количества пациенток имеется маточный фактор бесплодия, обусловленный наличием хронического воспаления в эндометрии и его истончением, называемым синдромом «тонкого» эндометрия.

Крайним проявлением синдрома «тонкого» эндометрия является синдром Ашермана, который характеризуется массивным фиброзом эндометрия, образованием фиброзных сращений между стенками матки и, в итоге, облитерацией полости матки [2].

Толщина эндометрия, М-эхо, < 7 мм ассоциирована со снижением вероятности наступления клинической беременности в протоколе ЭКО [3]. Однако авторы метаанализа не выявили достаточной степени статистической значимости снижения вероятности живорождения, что, видимо, связано с высокой вариабельностью в оценке М-эхо. Помимо получения разных значений М-эхо у одной и той же пациентки в различных ультразвуковых срезах, возможно ошибочное измерение внутренней части трехслойного эндометрия и занижение толщины эндометрия или, наоборот, завышение его толщины при захвате расширенной отекшей переходной зоны у пациентки с аденомиозом [4].

Регенеративная медицина является одним из наиболее стремительно развивающихся направлений. Еще в 2009 году в эндометрии были обнаружены мезенхимальные стволовые клетки (МСК), способные к дифференцировке [5]. Эндометрий — уникальная структура организма, поскольку каждый месяц после менструации и отторжения функционального слоя эндометрия происходит его регенерация, и образуется слой толщиной порядка 1 см. Таким образом, в лежащем под функциональным базальном слое эндометрия существует мощная система стволовых элементов, обеспечивающая эту регенерацию.

МСК стали распространенным объектом исследований в сфере регенеративной медицины, поскольку их достаточно легко получить при аспирационной биопсии костного мозга и они являются аутологичными, что снижает возможность развития реакций антигенной несовместимости. МСК способны дифференцироваться в клетки жировой, хрящевой, костной, мышечной ткани. Интересно, что МСК также способны дифференцироваться в нейроноподобные клетки [6].

Попадая в организм, МСК способны к хоумингу, самостоятельной миграции в поврежденные ткани, что дает возможность применять их не только топически, но и системно. В экспериментах с крысами показано, что введенные внутривенно МСК, выделенные из костного мозга, определяются в тканях эндометрия на протяжении 3 недель [7].

Цель данного исследования: оценить способность внутривенно введенных аутологичный МСК к миграции в эндометрий у пациенток, получающих МСК для лечения рефрактерного к заместительной гормональной терапии (ЗГТ) синдрома Ашермана.

Материалы и методы

В исследовании приняла участие 21 пациентка в возрасте 24–39 лет. Женщины проходили лечение бесплодия в ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта» (Санкт-Петербург) в 2020–2021 гг.

Критерии включения в исследование:

1) повторные неудачные попытки ЭКО и криопротоколы при наличии эмбрионов высокого качества;

2) М-эхо на фоне ЗГТ в протоколе подготовки к переносу эмбрионов < 6 мм не менее чем в двух попытках;

3) наличие фиброзно-склеротического процесса в полости матки, по данным гистероскопии, при отсутствии положительной динамики в результате проводимой ЗГТ в течение 3 месяцев после оперативного лечения;

4) наличие информированного согласия на проведение данного исследования.

Критерии исключения:

1) противопоказания к вынашиванию беременности;

2) отсутствие криоконсервированных эмбрионов высокого качества,

3) ИМТ > 30 кг/м²;

4) нарушения углеводного обмена, по данным перорального глюкозотолерантного теста;

5) венозные тромбоэмболические осложнения в анамнезе, тромбофилия;

6) онкологические заболевания в анамнезе;

7) миоматозный узел диаметром > 4 см или два и более миоматозных узла диаметром > 2,5 см;

8) узловая форма аденомиоза;

9) кисты яичников диаметром > 4 см.

Перед началом лечения проводилась рандомизация методом конвертов, были сформированы две группы: группа лечения МСК (n = 11) и группа контроля (n = 10). Для верификации синдрома Ашермана производилась гистероскопия с рассечением внутриматочных синехий при их обнаружении.

У пациенток группы лечения МСК выполнена трепан-биопсия гребня подвздошной кости под местной анестезией. Полученные образцы костного мозга инкубировались при 37ºС в атмосфере 5% СО₂. Среда для культивирования менялась на 100% каждые 4 дня. При достижении 80% конфлюэнтности производился пересев клеток (плотность пересева — 10 000 кл/см²). После первого пассажа МСК ресуспензировались в среде для культивирования в концентрации 2 × 10⁶/мл. Клеточная суспензия расфасовывалась по криовиалам в количестве 10 млн клеток/виала (2 мл). Предварительно суспензия смешивалась с охлажденной криозащитной смесью, состоящей из среды для культивирования (80% по объему) и диметилсульфоксида (20% по объему). Охлаждение проводилось в программном замораживателе при скорости снижения температуры 1°С/мин до –80ºС. В дальнейшем криовиалы хранились в жидком азоте.

Для реинициации клеток криовиалы размораживались в предварительно подогретой до 37ºС воде. Клетки ресуспензировались в среде для культивирования и помещались в СО₂-инкубатор. По достижении 80% конфлюэнтности производился сбор клеток. Полученные клетки трехкратно отмывались физиологическим раствором путем центрифугирования и удаления супернатанта. Осуществлялся забор проб для контроля качества. МСК в концентрации 5 млн/мл асептически расфасовывались в виалы емкостью 1,8 мл.

Для контроля качества в полученной культуре МСК оценивали параметры, представленные в таблице 1. Экспрессия поверхностных маркеров определялась с помощью проточной цитофлоуметрии (Beckman Coulter, Brea, CA, США). ДНК микоплазмы определялась с помощью ПЦР в реальном времени по общепринятой методике.

Таблица. 1. Параметры, оцениваемые при контроле качества мезенхимальных стволовых клеток

Параметры	Необходимые значения, %
CD90+	> 90
CD44+	> 90
CD105+	> 90
CD73+	> 90
CD45+	< 1
CD34+	< 0,5
Рост бактериальных колоний на стандартных средах	Отсутствует
ДНК микоплазмы	Отсутствует
Жизнеспособность клеток (по 7ADD)	> 90

В группе МСК перед терапией на 19–21-й день цикла проводилась пайпель-биопсия эндометрия для оценки экспрессии CD90+ с помощью иммуногистохимического исследования. Введение МСК выполнялось внутривенно на 7–9-й день менструального цикла. Через 3 месяца после введения МСК осуществлялась пайпель-биопсия эндометрия на 19–21-й день цикла для повторного определения экспрессии CD90+.

Пациентки в группе контроля получали стандартное лечение синдрома Ашермана: гистероскопическое разделение внутриматочных синехий с последующей терапией эстрогенами-гестагенами в циклическом режиме. Пайпель-биопсия для определения экспрессии CD90+ у них также выполнялась на 19–21-й день цикла до и через 3 месяца после начала лечения.

Морфологические методы включали гистологические исследование по стандартной схеме с окраской гематоксилином и эозином. При световой микроскопии оценивали соответствие строения эндометрия дню менструального цикла, состояние желез, стромы и сосудистого компонента эндометрия, наличие или отсутствие гистологических признаков воспалительных и патологических изменений. Исследование проводили на микроскопе Olympus CX31 (Япония) при 100- и 400-кратном увеличении.

Иммуногистохимическое исследование производили на парафиновых срезах толщиной 4 мкм, которые помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-L-лизина (Sigma-Aldrich, Япония). В качестве системы визуализации применяли abcam Mouse and Rabbit Specific HRP Plus (ABC) Detection IHC Kit (RTU) [ab93697] (Abcam, Великобритания).

Для проведения иммуногистохимической реакции использовали стандартный одноэтапный протокол с демаскировкой антигена (высокотемпературной обработкой ткани) в 0,01 М цитратном буфере рН 6,0.

Иммуногистохимическое исследование включало количественную и качественную оценку экспрессии СD 90+ (клон EPR3133) в стандартном разведении 1 : 100 производства Abcam (Великобритания). С использованием цифровой микроскопии рассчитывали процент площади иммунопозитивных клеток к общей площади препарата в программе ВидеоТест-Морфология 5.2.

Статистическая обработка данных осуществлялась с применением программ для статистического анализа SPSS Statistics. Нормальность распределения определяли с помощью критерия Колмогорова — Смирнова (во всех случаях p > 0,05), затем различия между группами оценивались при помощи дисперсионного анализа. Различия считали статистически значимыми при уровне значимости p < 0,05.

Результаты

Подробная характеристика пациенток до начала лечения представлена в таблице 2. Между исследуемыми группами не было статистически значимых различий по возрасту, ИМТ, продолжительности бесплодия, количеству попыток ЭКО в анамнезе. Первичное бесплодия имело место у 6 (54,5%) женщин из группы МСК и у 5 (50%) из группы контроля.

Таблица 2. Характеристика пациенток до начала лечения, среднее ± стандартное отклонение

Характеристики	Терапия МСК (n = 11)	Контроль (n = 10)
Возраст, годы	30,00 ± 4,34	31,20 ± 4,83
ИМТ, кг/м2	26,09 ± 2,66	24,50 ± 2,64
Продолжительность бесплодия, годы	4,18 ± 2,09	4,60 ± 2,22
Количество попыток ЭКО	3,27 ± 1,19	3,50 ± 1,08

В биоптатах эндометрия у 8 (38,1%) пациенток обеих групп до лечения в строме верифицирована мультифокальная экспрессия маркера CD 90+. В 5% биоптатов экспрессия отмечена только в люминальном эпителии пролиферативного и слабо секреторного эндометрия. Экспрессия соответствовала слабой и умеренной степени выраженности и не имела отличий в соответствии с морфологической характеристикой эндометрия (пролиферативный, слабо секреторный).

Через 3 месяца после лечения МСК экспрессия CD90+ верифицирована у 10 из 11 (91%) пациенток. При этом экспрессия CD90+ присутствовала в обеих гистогенетических структурах (в железах и в стромальном компоненте) (рис.). В группе контроля изменения экспрессии CD90+ не отмечались.

Рис. Иммуногистохимия. Экспрессия CD90+ в эндометрии через 3 месяца после терапии мезенхимальными стволовыми клетками, 200-кратное увеличение: А — экспрессия CD90+ в строме, Б — экспрессия CD90+ в железах. Иллюстрация авторов

Обсуждение

До недавнего времени одной из проблем клеточной терапии синдрома «тонкого» эндометрия при синдроме Ашермана являлся выбор пути введения стволовых клеток. Внутриматочное введение представлялось неоптимальным ввиду возможных технических сложностей при прохождении цервикального канала катетером для внутриматочного введения клеток, а также негерметичности матки и возможного истечения стволовых клеток из полости матки в цервикальный канал и влагалище.

Впоследствии было показано, что введенные внутривенно стволовые клетки способны мигрировать в эндометрий и оставаться там продолжительное время [7], что упростило исследования в этой области. Однако хоуминг стволовых клеток изучался на аутопсийном материале животных [7], по наличию Y хромосомы у пациенток, подвергшихся трансплантации костного мозга от донора мужчины [8], или по определению специфичных для донора лейкоцитарных антигенов HLA у женщин, подвергшихся трансплантации костного мозга [9], что, безусловно, неприменимо для изучения динамики хоуминга стволовых клеток у широкой когорты пациенток [10].

Нами изучена миграция введенных внутривенно МСК в эндометрий. Через 3 месяца после внутривенного введения МСК в биоптатах эндометрия верифицирована равномерная экспрессии CD90+ в строме и железах у 91% пациенток, что свидетельствует о миграции МСК в эндометрий.

Ограничением нашего исследования стало то, что на данный момент для МСК не обнаружен универсальный маркер кластера дифференцировки, который бы однозначно мог их идентифицировать. Обычно для идентификации МСК применяется сочетание экспрессии CD105, CD73, CD90 и отсутствие экспрессии CD45, CD34, CD14, или CD11b, CD79a, или CD19, HLA-DR [11], однако мультифокальное снижение и отсутствие экспрессии CD90+ в более 50% биоптатов до проведения терапии МСК и верификация экспрессии данного маркера в 91% случаев после проведения терапии являются, на наш взгляд, достаточным критерием подтверждения миграции МСК в эндометрий.

Заключение

Полученные нами данные свидетельствуют о способности внутривенно введенных аутологичных мезенхимальных стволовых клеток мигрировать в поврежденный эндометрий пациенток с рефрактерным к заместительной гормональной терапии синдромом Ашермана и сохраняться в тканях эндометрия на протяжении 3 месяцев.

1. Vander Borght M., Wyns C. Fertility and infertility: Definition and epidemiology. Clin. Biochem. 2018; 62: 2–10. DOI: 10.1016/j.clinbiochem.2018.03.012
2. Salazar C.A., Isaacson K., Morris S. A comprehensive review of Asherman's syndrome: causes, symptoms and treatment options. Curr. Opin. Obstet. Gynecol. 2017; 29(4): 249–56. DOI: 10.1097/GCO.0000000000000378
3. Kasius A., Smit J.G., Torrance H.L. et al. Endometrial thickness and pregnancy rates after IVF: a systematic review and meta-analysis. Hum. Reprod. Update. 2014; 20(4): 530–41. DOI: 10.1093/humupd/dmu011
4. Caserta M.P., Bolan C., Clingan M.J. Through thick and thin: a pictorial review of the endometrium. Abdom. Radiol. (NY). 2016; 41(12): 2312–29. DOI: 10.1007/s00261-016-0930-5
5. Gargett C.E., Schwab K.E., Zillwood R.M. et al. Isolation and culture of epithelial progenitors and mesenchymal stem cells from human endometrium. Biol. Reprod. 2009; 80(6): 1136–45. DOI: 10.1095/biolreprod.108.075226
6. Li Y., Yang J., Li M. et al. The extracts of human fetal brain induce the differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells into dopaminergic neuron containing cells. Cell Reprogram. 2020; 22(5): 254–61. DOI: 10.1089/cell.2020.0029
7. Liu Y., Tal R., Pluchino N. et al. Systemic administration of bone marrow-derived cells leads to better uterine engraftment than use of uterine-derived cells or local injection. J. Cell Mol. Med. 2018; 22(1): 67–76. DOI: 10.1111/jcmm.13294
8. Du H., Taylor H.S. Contribution of bone marrow-derived stem cells to endometrium and endometriosis. Stem Cells. 2007; 25(8): 2082–6. DOI: 10.1634/stemcells.2006-0828
9. Taylor H.S. Endometrial cells derived from donor stem cells in bone marrow transplant recipients. JAMA. 2004; 292(1): 81–5. DOI: 10.1001/jama.292.1.81
10. Chander V., Gangenahalli G. Emerging strategies for enhancing the homing of hematopoietic stem cells to the bone marrow after transplantation. Exp. Cell Res. 2020; 390(1): 111954. DOI: 10.1016/j.yexcr.2020.111954
11. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006; 8(4): 315–17. DOI: 10.1080/1465324060085590